Come usare gli ultrasuoni per la rottura cellulare e l'estrazione di DNA/RNA?

Come utilizzare gli ultrasuoni per la rottura delle cellule e l'estrazione di DNA/RNA?

L' ultrasuono è una tecnologia efficiente e comunemente utilizzata nella rottura delle cellule e nell' estrazione di acidi nucleici (DNA/RNA).Il suo principio fondamentale consiste nell' usare l' effetto di cavitazione e le vibrazioni meccaniche per distruggere la struttura cellulare e rilasciare le sostanze interneDi seguito è riportata una spiegazione del meccanismo specifico, della procedura di applicazione e delle principali precauzioni:

I. Principio e procedura dell'ecografia per la rottura delle cellule
Il nucleo della rottura cellulare è quello di distruggere la membrana cellulare (cellule animali) o la parete cellulare + membrana cellulare (piante, batteri, funghi, ecc.) per rilasciare sostanze intracellulari (come acidi nucleici,proteineL'ecografia realizza questo processo attraverso i seguenti meccanismi:
1Principio fondamentale: effetto di cavitazione
L'ecografia è un'onda meccanica ad alta frequenza con una frequenza superiore a 20 kHz.viene generata una vibrazione ad alta frequenza (di solito da 15-50 kHz), che innesca la cavitazione nel mezzo liquido:

Le vibrazioni ad alta frequenza causano la formazione di un gran numero di piccole bolle (bolle di cavitazione) nel liquido, che si espandono e si comprimono rapidamente sotto variazioni di pressione.e infine scoppiò violentemente (collasso).
Quando le bolle scoppiano, viene rilasciata un' enorme energia istantanea (temperatura elevata locale, alta pressione e forti onde d'urto),e la forza di impatto generata strapperà direttamente la struttura della membrana della cellula (membrana cellulare, parete cellulare) per ottenere la frammentazione cellulare.
2Effetti ausiliari: vibrazioni meccaniche e forza di taglio
Le vibrazioni meccaniche ad alta frequenza degli ultrasuoni generano anche direttamente forza di taglio e forza di attrito sulle cellule, contribuendo ulteriormente a distruggere la struttura cellulare,specialmente per le cellule con pareti cellulari spesse (come funghi e cellule vegetali).
3Processo di frammentazione (per esempio, operazione sperimentale)
Mettere la sospensione cellulare da trattare (come il liquido di coltura batterica, l' omogenato di tessuto, ecc.) in un tubo o un bicchiere di centrifuga, inserire la sonda ad ultrasuoni (corno),e la sonda deve essere immersa nel liquido ma non in contatto con la parete del contenitore.

Attivare lo strumento ad ultrasuoni e impostare i parametri (potenza, tempo, ecc.): le vibrazioni ad alta frequenza generano bolle di cavitazione nel liquido,e la forza di impatto generata dallo scoppio delle bolle distrugge direttamente la struttura cellulare e rilascia sostanze intracellulari (compresi gli acidi nucleici), proteine, metaboliti, ecc.).
2Applicazione specifica dell'ecografia nell'estrazione di DNA/RNA
I passaggi fondamentali dell'estrazione del DNA/RNA includono: interruzione cellulare per rilasciare acidi nucleici → rimozione delle impurità (proteine, lipidi, polisaccaridi, ecc.) → purificazione degli acidi nucleici.Il ruolo degli ultrasuoni è principalmente concentrato nel primo passo - l'efficiente interruzione delle cellule e il rilascio di acidi nucleiciGli scenari di applicazione specifici e i vantaggi sono i seguenti:
1Tipo di campione adatto
L'ecografia è adatta all'estrazione di acidi nucleici da una varietà di campioni, tra cui:

Tessuto animale (come fegato, muscolo): prima deve essere tagliato in piccoli pezzi, l' ultrasuono può interrompere rapidamente le cellule e rilasciare acidi nucleici;
batteri/funghi: le pareti cellulari sono relativamente dure, i metodi tradizionali (come il trattamento con lisozima) sono inefficienti e gli ultrasuoni possono distruggere le pareti cellulari attraverso un forte effetto di cavitazione;
Cellule coltivate (cellule aderenti o sospese): sospensione diretta e quindi ecografia, non è necessario un pretrattamento complesso;
Tessuto vegetale: contiene cellulosa e pectina, gli ultrasuoni possono aiutare a rompere le pareti cellulari e rilasciare il contenuto cellulare.
2Parametri chiave in funzione (che influenzano la qualità degli acidi nucleici)
Il trattamento ad ultrasuoni richiede un controllo rigoroso dei parametri per evitare la degradazione degli acidi nucleici o l'eccessiva frammentazione (che influisce sugli esperimenti successivi, come la PCR, il sequenziamento, ecc.):

Potenza: di solito 50-300W (adattata in base al tipo di campione, come i batteri che richiedono una potenza maggiore).e potenza troppo bassa si tradurrà in insufficiente frammentazione.
Tempo di lavoro/intervallo: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Tempo totale di trattamento: dipende dal campione (ad esempio 1-3 minuti per le cellule animali e 3-5 minuti per i batteri).
Controllo della temperatura: bagno di ghiaccio durante tutto il processo (i campioni vengono collocati sul ghiaccio), poiché il processo ad ultrasuoni genererà calore (effetto di cavitazione accompagnato da una temperatura elevata locale),La bassa temperatura può inibire l' attività della nucleasi e proteggere la stabilità degli acidi nucleici.

3. Vantaggi e precauzioni
Vantaggi
Alta efficienza: più veloce dei metodi tradizionali (come la macinatura, il congelamento e lo scioglimento ripetuti, l'idrolisi enzimatica) (di solito completata in pochi minuti) e un'interruzione più completa;
Universalità: applicabile a vari tipi di campioni (animali, piante, microrganismi, ecc.);
Facile da usare: non sono necessari reagenti complessi, sono necessari solo strumenti ad ultrasuoni e attrezzature di centrifugazione di base.
Precauzioni
Evitare bolle: se il campione contiene un gran numero di bolle, l'efficacia dell'effetto di cavitazione sarà ridotta e la sonda potrebbe surriscaldarsi.Assicurarsi che la sonda sia completamente immersa nel liquido (il livello del liquido è di circa 1-2 cm);
inibizione della nucleasi: dopo l' interruzione, deve essere aggiunta in tempo utile una soluzione di lisi (compresa EDTA, detersivo, ecc.) per inibire le nucleasi intracellulari (come la RNasi che degrada facilmente l' RNA);
Volume del campione: il volume di trattamento singolo non deve essere troppo grande (di solito ≤ 5 ml), altrimenti la distribuzione dell' energia ultrasonora sarà irregolare e l' effetto di interruzione varierà notevolmente.

Riassunto
Gli ultrasuoni interrompono efficacemente le cellule attraverso l'effetto di cavitazione e vibrazioni meccaniche, fornendo un "passaggio di rilascio" chiave per l'estrazione di DNA / RNA.tempo e temperatura per interrompere completamente le cellule massimizzando la protezione dell'integrità degli acidi nucleiciQuesta tecnologia è ampiamente utilizzata nella fase di pre-elaborazione degli esperimenti di biologia molecolare (come la clonazione genica, qPCR, analisi del transcritomo, ecc.).) ed è uno strumento importante per l'estrazione di acidi nucleici.